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PCR实验室设计与建设过程中应注意哪些问题

发布时间:2020-08-21

一、什么是PCR实验室

PCR是聚合酶链式反应(Polymerase Chain Reaction)的简称。聚合酶链式反应也可以当作一项极其重要的酶促合成DNA技术。PCR又称为无细胞克隆系统或特异性DNA序列体外引物定向酶促扩增法,是基因扩增技术的一次重大革新,它可将极微量的靶DNA特异地扩增上百万倍。

聚合酶链反应(PCR)是在DNA聚合酶催化下,以母链DNA为模板以特定引物为延伸起点,通过变性、退火、延伸等步骤,体外复制出与母链模板DNA互补的子链DNA的过程。是一项DNA体外合成放大技术,能快速特异地在体外扩增任何目的DNA。可用于基因分离克隆,序列分析,基因表达调控,基因多态性研究等许多方面。

一对合成DNA的引物经过高温变性、低温退火和中温延伸三个阶段为一个循环,每一次循环使特异区段的基因拷贝数放大一倍,一般样品是经过30次循环,最终使基因放大了数百万倍; 将扩增产物进行电泳,经溴化乙锭染色,在紫外灯照射下肉眼能见到扩增特异区段的DNA带。

二、设计要点

1、主体结构:

目前实验室的主体多为彩钢板、铝合金型材。室内所有阴角、阳角均采用铝合金R50内圆角铝,从而解决容易污染、积尘、不易清扫等问题。并且彩钢板结构牢固,线条简明,美观大方,密封性好。

2、标准的四区分隔和气压调节:

将PCR过程分成试剂准备、标本制备和PCR扩增区及产物分析检测区四个独立的实验区。整个区域有一个整体缓冲走廊。每个独立实验区设置有缓冲区,同时各区通过气压调节,使整个PCR实验过程中试剂和标本免受气溶胶的污染并降低扩增产物对人员和环境的污染。

3、消毒:

在四个实验区和四个缓冲区顶部以及传送窗内部安装有紫外灯,供消毒用。

在试剂准备区和标本制备区还设置移动紫外线灯,对实验桌进行局部消毒。

4、机械连锁不锈钢传递窗:

试剂和标本通过机械连锁不锈钢(不建议使用电子连锁方式)传递窗传递,保证试剂和标本在传递过程中不受污染(人物分流)。

5、地面

地面建议使用PVC卷材地面或自流坪地面,整体性好。便于进行清扫,耐腐蚀。没有条件的也可采用水磨石地面,或大块的瓷砖(至少800mm×800mm)接缝需要小于2mm。

6、照明

灯具要选用净化灯具,能达到便于清洗、不积尘的特点。

另外:

PCR实验室可分为两个大的功能工作区域:核酸扩增前区和核酸扩增后区。核算扩增前区包括试剂准备间和样本制备间,这个两房间各自独立,不能出现空气互通,这两个房间相对外界气压呈正压状态。核酸扩增后区包括扩增区和产物分析区,使用实时荧光PCR仪、HIV病毒载量测定仪的PCR实验室,这个两区域可以合并为一个房间。这个区域如果是分开两个房间,这两个房间也必须是各自独立,不能出现空气互通。核算扩增后区对外界气压呈负压状态。

‚PCR实验室根据使用仪器的功能合理设置各个工作区域,如采用聚合酶联反应:则设置试剂储存和准备区、标本制备区、扩增区、扩增产物分析区四个单独的工作区域,这是最常用的分区方式。样品需要粉碎处理的,还需增设样品粉碎区;若使用实时荧光PCR法:基因扩增区、基因产物分析区可以合并在一个房间内;采用标本处理、核酸提取及扩增检测为一体的全自动化PCR分析仪,则标本制备区、扩增区、扩增产物分析区可合并为一个区域,因此PCR实验室原则上设置五个区或四个区或三个区或二个单独的工作区。

ƒ核酸扩增前区和核酸扩增后区可设在一个房间内,但必须在满足下列要求的前提下:

核酸扩增前区实验室内设置两个不同位置的实验区,试剂配置在超净工作台中操作,样品处理在生物安全柜内操作。

在核酸扩增后区使用全封闭的扩增和检测系统,如实时荧光PCR仪等。

每个实验人员使用各自的试剂、耗材、移液器和盛放污染物的盛器。

在实验前后对操作区域和共享器具进行清洁及消毒。

各区域的试剂、器具、仪器和设备为该区专用,不得交叉使用。

三、空气流与压差要求

PCR实验室的空气流向必须严格按照试剂储存和准备区→标本制备区→扩增区→扩增产物分析区空气压力逐渐递减方式进行,防止扩增产物顺空气气流进入扩增前的区域。风速流向不得混乱。

为了保证房间内的压差和避免污染,应在空调面板处写清楚送风机和排风机的开启顺序和关闭顺序,先后顺序不得混乱。

空气洁净级别不同的相邻房间之间的静压差应大于5帕,洁净室(区)与室外大气的静压差应大于10帕,应配备监测静压差的设备,并定期监控。
一般情况下,试剂配制室及样品处理室宜呈微正压,以防外界含核酸气溶胶的空气进入,造成污染;可以通过控制进风风量大于排风风量达到正压效果。

核酸扩增室及产物分析室应呈微负压,以防含核酸的气溶胶扩散出去污染试剂与样品,可以通过控制排风风量大于进风风量达到负压效果。

在理想情况下,PCR实验室缓冲间内,可设置正压,使室内空气不流向室外,室外空气不流向室内。 PCR实验室进风由原有中央空调控制的要求将中央空调风口安装到指定定点。

四、实验室面积及设备间距

一般来说各房间的面积没有严格要求,只需能放置所需仪器设备,并且便于人员操作即可,但是有生物安全柜的房间面积不能小于10平米,并且每增加一台生物安全柜,房间就要增加10平米。

各实验室缓冲间的面积一般为1300*(1300或1500)mm为宜,并且缓冲间的面积不能大于实验室房间面积的1/8。

在做平面设计的时候,首先要考虑的因素是就是“安全”,实验室是最易发生爆炸、火灾、毒气泄露等的场所。我们在做平面设计的时候,应尽量地要保持实验室的通风流畅、逃生通道畅通。根据国际人体工程学的标准。我们做如下的划分以供参照:
实验台与实验台通道划分标准(通道间隔用L表示)
L>500mm时,一边可站人操作;
L>800mm时,一边可坐人操作;
L>1200mm时,一边可坐人,一边可站人,中间不可过人;
L>1500mm时,两边可坐人,中间可过人;
L>1800mm时,两边可坐人,中间可过人可过仪器
天平台、仪器台不宜离墙太近,离墙400mm为宜。为了在工作发生危险时易于疏散,实验台间的过道应全部通向走廊。另:实验室建筑层高宜为3.7米-4.0米为宜,净高宜为2.7米-2.8米,有洁净度、压力梯度、恒温恒湿等特殊要求的实验室净高宜为2.5米-2.7米(不包括吊顶);实验室走廊净宽宜为2.5米-3.0米.普通实验室双门宽以1.1米-1.5米(不对称对开门)为宜,单门宽以0.8米-0.9米为宜。

五、洁净装修要求

洁净室(区)的内表面应平整光滑、无裂缝、接口严密、无颗粒物脱落,并能耐受清洗和消毒,墙壁与地面的交界处宜成弧形或采取其他措施,以减少灰尘积聚和便于清洁。
洁净室(区)内各种管道、灯具、风口以及其他公用设施,在设计和安装时应考虑使用中避免出现不易清洁的部位。

洁净室(区)的窗户、天棚及进入室内的管道、风口、灯具与墙壁或天棚的连接部位均应密封。

六、工作服要求

在净化车间内工作的人员应穿着符合要求的工作服。工作服的选材、式样及穿戴方式应与生产操作和空气洁净度级别要求相适应,并不得混用。洁净工作服的质地应光滑、不产生静电、不脱落纤维和颗粒性物质。无菌工作服必须包盖全部毛发、胡须及脚部,并能阻留人体脱落物。不同空气洁净度级别使用的工作服应当分别清洗、整理,必要时消毒或灭菌。工作服洗涤、灭菌时不应带入附加的颗粒物质。工作服应制定清洗周期。

进入各个区域必须严格按照单一方向进行,不同的工作区域使用不同的工作服(例如不同的颜色)。工作人员离开时,不得将工作服带出。

实验室应建立、执行人员进出洁净区的清洁程序和管理制度,人员清洁程序合理。

七、人流路径与物流路径

进入实验室区域工作人员应该按照以下路径:

公共清洁区——更衣间(更换洁净服)——缓冲间——污染实验区

工作人员退出实验室的路径为:

污染试验区——缓冲间——淋浴间(有条件的可设置)——更衣间——公共清洁区

所有的物品进入实验区必须经过双扉互锁传递窗,利用传递窗消毒后才可进入,实验室内所有物品的也必须经过传递窗才可以传递到实验室以外的清洁公共区。

八、门的开启方向

实验室建筑层高宜为3.7米-4.0米为宜,PCR实验室净高宜为2.5米-2.7米(不包括吊顶);实验室走廊净宽宜为2.5米-3.0米.普通实验室双门宽以1.1米-1.5米(不对称对开门)为宜,单门宽以0.8米-0.9米为宜。

一般实验室门主要向里开,但如有危险的房间,房门应朝外开,房门材质最好选择压力玻璃。

有压差梯度的房间,门的开启方向应朝向正压方向一侧开启;

考虑到消防安全,对于那些主要逃生门的开启方向应朝向清洁区方向开启。

九、基本仪器设备考虑

(1)试剂贮存和准备区

该实验区主要进行的操作为贮存试剂的制备、试剂的分装和主反应混合液的制备。试剂和用于样品制作的材料应直接运送至该区,不得经过其他区域。试剂原材料必须贮存在本区内,并在本区内制备成所需的贮存试剂。对与气流压力的控制,本区应对外界保持微正压。

试剂准备区仪器设备主要应有加样器、冰箱、天平、低速离心机、混匀器、可移动紫外灯等。可使用超净工作台作为试剂配制操作台面。

(2)标本制备区

该区域主要进行的操作为样本的保存、核酸(RNA、DNA)提取、贮存及其加入至扩增反应管和测定DNA的合成。本区的压力梯度要求为:相对于邻近区域为正压,以避免从邻近区进入本区的气溶胶污染。另外,由于在加样操作中可能会发生气溶胶所致的污染,所以应避免在本区内不必要的走动。

标本制备区仪器设备主要应有生物安全柜(最好为B2,可避免提取核酸在柜内反复循环,造成标本间交叉“污染”,出现假阳性结果。此外还应配备加样器、台式高速离心机(冷冻及常温)、台式低速离心机、恒温设备(水浴和/或干浴仪)、冰箱、混匀器和可移动紫外灯等。

(3)扩增和扩增产物分析区

该区域主要进行的操作为DNA扩增和扩增片段的测定。此外,已制备的DNA模板(来自样本制备区)的加入和主反应混合液(来自试剂贮存和制备区)制备成反应混合液等也可在本区内进行。本区的压力梯度要求为:相对于邻近区域为负压,以避免气溶胶从本区漏出。为避免气溶胶所致的污染,应尽量减少在本区内的不必要的走动。个别操作如加样等应在超净台内进行。

扩增区主要仪器就是核酸扩增热循环仪(PCR仪,实时荧光或普通的)。热循环仪的电源应专用,并配备一个稳压电源或UPS,以防止由于电压的波动对扩增测定的影响。此外,根据工作需要,还可配备加样器、超净台等。

产物分析区:本区所使用的仪器设备可能有加样器、电泳仪(槽)、电转印仪、杂交炉或杂交箱、水浴箱、DNA测序仪、酶标仪和洗板机等。

十、实验室风量测算

1、排风量的计算方法:
根据面风速来确定排风量(面风速的一般取值为:0.3~0.5 m3/h)
计算公式:G=S•V•h•μ
=L•H•3600•μ
其中    G:排风量       S:操作窗开启面积
V:面风速       h: 时间(1小时)
L:通风柜长度   H: 操作窗开启高度
μ: 安全系数(1.1~1.2)
例:1200L的通风柜其排风量计算如下:
G:1.2*0.75/2*0.8*3600*1.2=1555 m3/h
经验值:1200L通风柜排风量一般为1500 m3/h
1500L的通风柜排风量一般为1800 m3/h
1800L的通风柜排风量一般为2000 m3/h
注:中央台上用排风罩排风量的计算方法同通风柜排风量的计算方法

原子吸收罩排风量的计算方法:
根据罩口风速来确定排风量(罩口风速的一般取值:1~2 m3/h)
计算公式:G=πR²•V•3600•μ
其中  G:排风量       R:罩口半径
V:罩口风速    μ:安全系数(1.1~1.2)
经验值:一般情况下原子吸收罩的排风量在500~600 m3/h
整体通风的排风量计算方法
计算公式:G=V•n•h=L•W•H•n•h
其中  G:排风量     V:房间体积
n:换气次数 (一般取8~12次)    h:时间(1小时)
2、实验室风压的计算
管线沿程阻力约5Pa/米,弯头阻力为10~30 Pa/个,三通阻力为30~50 Pa/个。
注:所有阻力之和乘以安全系数(1.1~1.2)即为风压值。
3、通风管线风量的计算
一般情况下国家标准的风管风速取值范围为V=6~8m/s  (考虑到风量的损耗,我们标准的风管风速取值范围为V=8~12m/s)
计算公式:G=S•V•3600=πR²•V•3600→R=[G/(π•V•3600)]½
其中 G:排风量(根据上述计算得出)    R:风管半径    V:风管风速
注:矩形风管的尺寸有如下几种固定尺寸:120、150、200、250、300、400、500、630、800、1000、1200、1400、1600、1800  (如需由圆形管变为矩形管,设计原则是面积相等)
以下是部分通风管线的风量计算参考值

类型 规格(mm) 排风量m3/h
圆形
风管 Φ160 578.76
Φ200 904.32
Φ300 2034.72
Φ400 3617.28
矩形
风管 200*200 1152
300*300 2592
400*400 4608

十一、安全注意问题

A、生物安全柜的摆放位置不易摆放在与出入口紧邻的墙体上;

B、实验室内的通讯设施应该放置于生物安全柜对面;

C、实验室门口位置设置紧急洗眼器和紧急喷淋,以防止实验人员受到伤害;

D、高压灭菌器应与传递窗紧邻;

E、实验室内的压力显示器和报警装置都应放置在醒目位置;

F、与室外联系的电话应放置在醒目位置,并且放置在便于实验室人员快速拿起的位置;

G、实验室应该具有防止昆虫和其他动物进入的措施。

十二、PCR实验室管理 

(1)严格控制进出实验室的人员。与实验无关的人员不得随意进出实验室,有条件的情况下要设置独立的通道和进出整个实验区的门;

(2)尽量减少在实验区内不必要的走动以减少交叉污染的可能性;

(3)扩增产物分析区是最主要的扩增产物污染来源,废液不能在实验室中倾倒,必须经消毒液浸泡消毒后在远离实验室的地方弃掉,用过的吸头等一次性材料也应经消毒液浸泡消毒后统一处理,如焚烧等;

(4)扩增产物分析区可能会用到某些可致基因突变和有毒物质,应特别注意实验人员的安全防护。

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